디지털 PCR 은 대상 시퀀스의 복사본 수를 직접 계산할 수 있으므로 샘플과 표준 곡선에 의존하지 않고도 정확한 절대 정량 테스트를 수행할 수 있습니다. 또한 디지털 PCR 은 결과 해석을 수행할 때 두 가지 증폭 상태만 판단하기 때문에 형광 신호와 설정 임계값선의 교차점을 감지할 필요가 없고 Ct 값의 식별에 전혀 의존하지 않기 때문에 디지털 PCR 의 반응은 증폭 효율의 영향을 크게 받고 PCR 반응 억제물에 대한 내성이 크게 높아졌다. 디지털 PCR 실험에서 표준 반응 시스템 할당 프로세스는 대상 시퀀스와 경쟁적인 배경 시퀀스 농도를 크게 낮출 수 있으므로 디지털 PCR 기술도 복잡한 배경에서 희귀한 돌연변이를 감지하는 데 특히 적합합니다.
A: 최소 마이크로방울의 양은 실험의 돌연변이 비율 민감도 요구 사항과 관련이 있습니다. 인간 cfDNA 의 구체적인 요구 사항은 아래 표
이론적으로 음성 마이크로방울이 1 개 더 있으면 ddPCR 은 Possion 분포에 따라 샘플 함량을 계산할 수 있지만 CV 는 매우 클 수 있습니다. 허용 가능한 동적 범위는 CVlt； 입니다. 5 의 샘플 함량 범위. 모든 dPCR 플랫폼의 경우 최적의 샘플 농도는 0.16 에 해당하는 농도입니다. 이때 CV 는 가장 작은 (~1.5) 이며, 해당 농도가 가장 좋습니다. 그러나 실제 테스트에서 샘플 농도는 플랫폼 요구 사항의 동적 범위 내에서 OK 의
, 20,000 개의 마이크로방울의 경우 샘플 농도의 상한 (이론적으로 λ=5.5), 해당 양성 마이크로방울의 비율은 99.6, 여성 마이크로방울의 비율은 0.4 로 여성 마이크로방울의 수에 해당합니다. 즉, 80 개가 넘는 음성 마이크로방울은 OK 입니다. 이론적으로는 더 적을 수 있지만, 다른 불확실성을 감안하면 실측 결과
A: 마이크로드립 수가 9000 개 미만이며 통계적으로 샘플 양이 너무 적어 포아송 분포 보정을 사용할 수 없습니다. 특히 고농도 샘플의 경우 양적 오차가 비교적 크고 상한선을 감지할 수 있습니다. 복합 구멍이 있는 경우, 복합 구멍 사이의 모든 미세 방울은 독립 반응 시스템이므로, 복합 구멍 데이터를 결합하여 분석하여 복합 구멍을 하나의 구멍으로 처리할 수 있습니다.
QX200 시스템의 경우 반응 볼륨이 20 마이크로리터이면 생성된 마이크로방울의 수는 약 20,000 개입니다. 실제 검사는 20,000 개 미만이며, 종종 시스템의 죽은 부피, 마이크로방울 이동 시 손실 및 기타 불확실성에서 비롯된다. 즉, 마이크로 드립 준비 후, 표적 핵산은 20,000 개의 마이크로 드립에 무작위로 분포되어 있으며, 양성 마이크로 드립의 비율이 확립되었으며, 이후 분석 된 마이크로 드립의 수는 20,000 개 미만이며 양적 결과에 영향을 미치지 않습니다 (적절한 농도의 샘플). 사실, 우리는 또한 같은 샘플, 다른 배치 테스트, 4000-20000 에서 총 마이크로 방울의 수를 만났다, 하지만 양적 결과는 다르지 않습니다. 앞서 언급한 바와 같이' 농도가 적당한 샘플' 을 전제로, 샘플 농도가 너무 높고 너무 낮을 때 분석한 총 마이크로방울 수가 적으면 또 다른 부분의 subsampling error 가 증가하여 정량의 정확성과 정밀도가 영향을 받을 수 있습니다. 그렇다면 왜 8,000 개의 마이크로방울을 정의하는가 하는 것은 품질 관리의 관점에 기반을 두고 있다. 이렇게 많은 작은 방울에 도달하지 못했으니, 틀림없이 문제가 있을 것이다. 다시 하는 것을 건의한다. 반면 농도가 매우 높거나 매우 낮은 샘플의 경우 8000 개의 작은 방울로 인한 오차는 여전히 샘플 자체의 샘플링 오차보다 작습니다.
A: 샘플의 단백질, 유기용제, 표면활성제, 고점도 물질, 마이크로방울을 생성할 때의 주변 온도, PCR 등의 요인이 마이크로방울의 수에 영향을 줍니다. 혈액 샘플에서 주로 단백질 잔류물과 추출 과정에서 제거되지 않은 알코올로 판단된다.
A: 프라이머 프로브는 일반적으로 물이나 TE 용해되며 전체 20 마이크로리터 반응체계 내에서 비중이 적기 때문에 최종 반응체계의 이온 강도나 pH 에 미치는 영향이 매우 낮습니다. 그리고 ddPCR 반응 사전 혼합 자체는 완충액으로 비교적 안정적인 pH 를 유지할 수 있다. 샘플도 일반적으로 TE 또는 순수세탁입니다. 추출이 문제가 없다면 시스템에도 거의 영향을 주지 않습니다. 단, 매우 높은 소금 이온 농도가 미세한 방울의 침투압을 증가시켜 안팎의 균형에 영향을 줄 수 있지만, 일반인의 피는 등 침투 용액으로 이렇게 높은 소금 농도는 없을 것입니다. 테스트 키트 추출에 문제가 없고, 기둥이 농축될 때 샘플 중 너무 높은 이온 농도를 씻을 수 없습니다. (존 F. 케네디, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 건강명언) 샘플의 단백질, 유기용제, 표면활성제, 고점도 물질에 비해 미세한 방울에 미치는 영향은 미미하다.
A: 결국 10,000 개 이상의 유효 물방울이 측정되었고, 1 차원 그래프의 물방울 높이에 계단식 배열이 나타나지 않아 물방울이 안정적인 것으로 간주됩니다.
a: DDPCR 실험의 유효성은
이론감도는 1 개의 복제 핵산이다. 실제 감도는 Assay 및 추출 수단에 따라 구체적으로 분석해야 하며, 반복성은 Assay 에 따라 농도 범위마다 다릅니다. 참고 문헌, 자체 실험 또는 FDA 의료 기기 등록 시 검증 데이터가 필요합니다.
PCR 기기의 경우 일반적으로 분석 감도를 거의 사용하지 않습니다. 각 시퀀스는 서로 다른 분석물로 판단될 수 있고, 동일한 방법은 서로 다른 분석물의 LLD, BLD, AS, FS 에 따라 다르며, 서로 다른 응용 프로그램 방향과 응용 프로그램 시약 간에 정확해야 하기 때문입니다.
a: bio-rad 에 따라 ddPCR supermix 에 따라 작은 방울 볼륨이 다릅니다. 따라서 setup 실험 시 소프트웨어에서 해당 supermix 종류를 제대로 선택해야 하는 경우 소프트웨어가 계산을 위해 해당 시약 작은 방울 볼륨을 자동으로 호출합니다. 서로 다른 시약 의 작은 방울 볼륨 은 개발 시 이미 테스트 를 거쳐 quantasoft 소프트웨어 의 계산 중
< P > < A > A: 1. 1. 단일 구멍 마이크로 방울 수 부족, 2. 단일 구멍 샘플 의 샘플 양 이 부족, 3. 계산 기술 중복 간 의 평균 과 신뢰 구간 이다. 실험에서 perform 기술 반복이 있는 경우 일반적으로 merge 각 기술이 반복되는 마이크로방울을 분석하여 데이터의 정확도를 높이는 것이 좋습니다.A: 이중 ddPCR 실험에서 이중 반응 간에 서로 간섭하거나 경쟁하는 경우 (일반적으로 4 개의 마이크로방울이 직사각형 선에 있을 수 없는 경우) 케이블을 사용합니다. (예가 있으면 현장에서 토론할 수 있음)
이 두 가지 양적 결과는 사실 모순이 아니다. 그러나 ddPCR 이 개발한 mutation detection assays 의 경우 복제본 수를 사용할지 돌연변이율을 LOD 로 사용할지 여부는 아직 논의되지 않았다. Liquid biopsy 의 경우 두 가지 테스트 결과를 동시에 분석하는 것이 더 실용적일 수 있습니다. 개인은 사본 수 농도를 사용하는 경향이 있고, 야생형의 결과는 필수 IPC 이다. 돌연변이 비율의 측정은 샘플 준비의 영향을 받을 수 있다.
새로운 형광 마크를 추가하거나 음성 마이크로방울을 넣은 배경 형광 신호가 음수인 경우 보정이 필요합니다.