Annexin V-EGFP 세포사멸 검출 키트
제품 설명:
세포사멸은 일종의 프로그램화된 세포사멸로, 세포 괴사와 관련이 있습니다. 차이점. 포스파티딜세린(PS)은 세포막의 성분입니다. 정상 세포에서는 주로 세포막 내부에 분포합니다. 세포 사멸의 초기 단계에서 PS는 세포 표면, 즉 세포막 외부로 이동합니다. 세포막. Annexin V는 PS에 대한 높은 친화력을 가지며 선택적으로 PS에 결합하고 라벨을 붙일 수 있습니다. 본 키트는 재조합 인간 Annexin V-EGFP 융합 단백질을 사용하여 세포사멸 시 세포막 표면에 나타나는 PS를 검출하고 세포사멸 세포를 식별합니다. 괴사성 세포와 후기 단계의 세포사멸 세포이므로 막 안쪽의 PS도 Annexin V에 결합할 수 있으며 일반적으로 살아있는 세포의 또 다른 비투과성 형광 염료인 요오드화 프로피듐(PI)으로 이중 염색됩니다. 초기 세포사멸 세포와 괴사 세포, 후기 세포사멸 세포를 구별합니다. Annexin V-EGFP 및 PI로 염색한 후 정상적인 살아있는 세포는 Annexin V-EGFP 및 PI로 염색되지 않으며, 세포사멸 초기 단계의 세포는 Annexin V-EGFP로 염색되며 PI 염색은 음성입니다. 세포사멸의 후기 단계에서는 Annexin V-EGFP와 PI에 의해 동시에 염색될 수 있습니다. 유세포 분석법이나 형광 현미경을 사용하여 세포 사멸의 중요한 특징인 PS 외형을 직접 관찰하는 것은 세포 사멸을 검출하는 빠르고 쉬운 고전적인 방법입니다.
조작 방법:
염색액 준비:
1) 4x Annexin V 접합액 적당량을 취하여 2차 증류수로 희석하여 1xAnnexin으로 만듭니다. V 접합 솔루션. 모든 후속 작업에서는 1x Annexin V 바인딩 솔루션을 사용했습니다.
2) Annexin V 결합 완충액 1ml에 Annexin V-EGFP 20μl를 첨가하여 10회 테스트용 Annexin V 염색 용액을 준비합니다.
3) Annexin V 결합 완충액 5ml에 PI 5μl를 첨가하여 10회 테스트용 PI 염색 용액을 준비합니다.
형광현미경 사진 작업 방법:
1) 배양된 세포를 필요한 방법으로 처리하여 세포사멸을 유도합니다. 음성 대조군도 동시에 설정해야 합니다.
2) 부착성 성장 세포의 경우, 원심분리기를 사용하여 배양 배지에 부유된 세포를 수집하고, 부착성 세포를 트립신으로 분해한 다음, 부유성 성장 세포용 세포 현탁액의 두 부분을 합하여 직접 세포를 수집합니다. . 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세척한 후 1000g에서 5분간 원심분리하고 상청액을 버리고 100μl의 Annexin V 염색 용액을 첨가하여 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다. 실온(20~25°C)에 놓고 10~15분 동안 배양합니다. 그런 다음 PI 염색 용액 0.5ml를 추가하고 잘 섞습니다. 실온에서 5분간 배양합니다.
3) 배양이 완료되면 1000g에서 5분간 원심분리하고 상등액을 버리고 세포를 50~100μl의 Annexin V 결합 완충액에 천천히 재현탁합니다. 세포 현탁액을 현미경 슬라이드에 넣고 커버슬립으로 덮습니다.
4) 형광현미경 하에서 청색광을 사용하여 세포의 적색 방출 이미지를 자극하고 관찰하고 사진을 찍습니다. Annexin V-EGFP에 결합하는 세포사멸 세포의 원형질막은 녹색 후광을 나타내며, 불완전한 막 구조를 갖는 괴사 세포와 후기 단계의 세포사멸 세포는 전체 핵 영역에서 PI에 의해 빨간색으로 염색되는 반면, Annexin V-EGFP의 원형질막은 빨간색으로 염색됩니다. EGFP 양성 세포는 녹색으로 나타납니다.
5) 48-well plate 또는 96-well plate에서 배양된 부착세포는 in situ 염색도 가능합니다. 세포사멸 유도 후, 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 부드럽게 세척하고 PBS를 완전히 제거한 다음 Annexin V 염색 용액 100 μl를 첨가하고 실온에서 10~15분 동안 배양하고 염색 용액을 흡인한 다음 PI 염색 용액 0.5 ml를 첨가하고 잘 섞는다.
실온에서 5분간 배양합니다. 도립형광현미경으로 즉시 관찰하십시오.
유세포 분석 작업 방법:
1) 배양된 세포를 필요한 방법으로 처리하여 세포사멸을 유도합니다. 음성 대조군도 동시에 설정해야 합니다.
2) 부착성 성장 세포의 경우 트립신으로 소화하여 현탁 성장 세포의 경우 단일 세포 현탁액을 준비하고 세포를 직접 수집합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세척한 후 재현탁된 세포 50,000~100,000개를 취하여 1000g에서 5분간 원심분리하고 상층액을 버리고 100μl Annexin V 염색 용액을 첨가하여 세포를 부드럽게 재현탁합니다. 실온(20~25°C)에 놓고 10~15분 동안 배양합니다.
3) PI 염색액 0.5ml를 넣고 잘 섞어주세요. 실온에서 5분간 배양합니다.
4) 배양이 완료되면 즉시 유세포 분석을 수행합니다. 488 nm에서 이중 파장 여기를 사용하고 ~510 nm 및 >575 nm에서 방출을 측정하여 세포를 3개의 하위 그룹으로 나누어야 합니다. 살아있는 세포는 형광 강도가 매우 낮고, 세포사멸 세포는 강한 녹색 형광을 가지며, 괴사 세포는 매우 낮은 형광 강도를 나타냅니다. 후기 세포사멸 세포) 녹색 및 적색 형광 이중 염색.
참고:
1) 이 키트는 살아있는 세포만 검출할 수 있으며 절단, 긁기, 고정 또는 침윤된 세포 샘플을 검출하는 데 사용할 수 없습니다. 고정된 살아있는 세포에 대해 다른 테스트를 수행해야 하는 경우, 본 키트로 라벨링한 후 Annexin V 바인딩 버퍼로 세포를 세척한 후 후속 작업을 위해 고정할 수 있습니다.
2) 세포사멸은 계속해서 변화하는 역동적인 과정입니다. 세포사멸을 관찰하려면 적절한 유도 시간을 선택하는 것이 중요합니다.
3) Annexin V와 PI로 염색된 생존 세포는 가능한 한 빨리 검사해야 합니다.
4) 세포 시료나 시약의 미생물 오염으로 인해 잘못된 관찰 결과가 발생할 수 있습니다.