예 1: BD 스트리밍 기기 FACSCalibur 시약 선택 및 FAQ
1, 스트리밍 항체 형광 마크
스트리밍 항체 형광 마크와 함께 사용하는 방법은 주로 스트리밍 세포라는 세 가지 요인에 의해 결정됩니다 스트리밍 세포계의 통로가 많을수록 같은 샘플이 동시에 만들 수 있는 표면/세포 내 마크가 많을수록
A,? 스트리밍 세포계에 따라 스트리밍 항체
1) 을 어떻게 배합합니까? BD 스트리밍 세포계 (06 판 카탈로그 614 페이지)
스트리밍 세포계가 감지할 수 있는 채널 수는 몇 개의 레이저 수와 각 레이저의 기능에 의해 결정되므로 먼저 두 가지 점에 유의해야 합니다.
스트리밍 세포계에 어떤 레이저가 있는지. 예를 들어 표준 FACSCalibur 는 488nm 레이저 1 개만으로 FL1, FL2, FL3 형광채널 3 개/색상 3 개, Calibur 옵션? (FACSCalibur 의 약어) 488nm 및 635nm 레이저 두 개가 장착되어 FL1-FL4 채널 4 개/색상 4 개를 감지할 수 있습니다.
형광소를 감지하는 기능은 모델마다 다릅니다. 예를 들어 Calibur 의 FL3 (채널 3) 이 PE-Texas 를 감지할 수 있습니까? 레드,? PE-Cy5,? PerCP,? PerCPCy5.5, PE-Cy7, Aria 의 3 번 채널은 PE-TexasRed 만 감지할 수 있습니다. PE-Cy5,? PerCP 입니다. Calibur 3 채널에서 감지할 수 있는 PerCP-Cy5.5 는 FACSAria 에서 4 번 채널 감지입니다. Calibur 와 LSR 모두 4 가지 색상을 감지할 수 있지만 네 번째 채널 감지 형광소는 다르다.
형광소 원칙
< P > 스트리밍 형광소 2 가지 원칙이 있습니다. 채널당 1 가지 형광소만 선택할 수 있습니다. 각 채널 사이의 형광소는 마음대로 코디할 수 있지만
1, 채널당 한 가지 형광소만 선택할 수 있다는 점에 유의해야 한다. Calibur 를 예로 들면, Calibur 의 FL1 채널이 FITC 를 선택하면 AlexaFluro488 을 선택할 수 없거나 Alexa 를 선택할 수 있습니까? Fluro488 은 FITC 를 선택할 수 없습니까? Calibur 의 FL3 채널은 PE-Texas 를 감지할 수 있지만? 레드,? PE-Cy5,? PerCP,? PerCP-Cy5.5,? PE-Cy7 은 5 개의 형광소를 가지고 있지만, 우리가 코디할 때는 그 중 하나만 선택할 수 있습니다.
2, 채널 간 형광소는 자유롭게 코디할 수 있습니다. 고객의 스트리밍 세포계가 4 개의 채널을 만들 수 있고, 1 번째 원칙에 따라 각 채널마다 1 개의 형광소를 임의로 선택하면 4 개의 색상으로 조합할 수 있습니다. 2 와 레이저의 칼리버를 예로 들면 칼리버의 각 형광소 사이에 16 가지 조합을 매치할 수 있다.
예를 들어 일반적인 코디는 f? I? T? C (? F? L? 1? )+p? E(F? L? 2)+percp (fl3)+APC (fl4),? 이 코디 조합은 알렉스로 바꿀 수 있나요? Fluro (fl1)+PE (fl2)+percp (fl3)+APC (fl4),? 아니면 FITC (fl1)+PE (fl2)+percp (fl3)+알렉스? Fluro(FL4) 또는 FITC (fl1)+PE (fl2)+PE-cy5 (fl3)+APC (fl4) 등. 결론적으로, 제 1 원칙에 따라, 우리는 각 형광소를 마음대로 배합하고 조합할 수 있다.
그러나 APC 와 PE-Cy5 를 함께 사용하면 상류가 흐른 후 과도한 보상
B,? BD 회사 항체 몇 가지 형광소
1)? 공급자가 제공할 수 있는 각 항체 형광소는 다르다. 우리는 동시에 공급자가 제공할 수 있는 각 항체 형광소를 결합해야 한다. 원칙적으로 같은 로고의 서로 다른 복제 번호띠는 형광소 1 개와 같은 응용에서는 차이가 없지만, 복제 번호가 다른 항체 사이에는 약간의 차이가 있을 수 있으므로 설명서를 자세히 살펴보아야 한다. (데이비드 아셀, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 예술명언) 설명서에 스트리밍 그래픽이 있는 항체 또는 형광소 종류가 가장 많은 클론 번호의 항체
2 를 선택할 수 있습니까? 형광소
는 www.bdbiosciences.com/spetra 에 접속해 형광소와 감지된 BD 스트리밍 세포기 모델 및 자극광을 입력하면 해당 파장을 찾을 수 있다.
왜 Alex 를 추천합니까? Fluro488 과 Alex? Fluro647 은요?
이러한 형광은 매우 밝고 레이저에 매우 안정적이기 때문에 스트리밍 세포계의 스펙트럼 특성에 적합하며 PH 값에 민감하지 않고 수용성이 있습니다. 게다가, 그들이 함께 사용할 때 방출 스펙트럼에는 큰 차이가 있어 보상할 필요가 없다.
C, 감지된 지표 수가 스트리밍 세포계의 채널을 초과하면 어떻게 합니까?
5 개의 지표를 만들어야 하는데 스트리밍 세포계는 4 개의 채널만 할 수 있다면 먼저 지표를 2 개 범주로 분류한 다음 샘플을 2 개로 나누어 개별적으로 탐지한다. 예를 들어 CD3, CD4, CD8, IL-4 및 IFN-gamma 를 동시에 검사해야 하는 경우 샘플을 두 개로 나눕니다. 첫 번째는 CD3, CD4, CD8 및 IL-4 를 추가하고 두 번째는 CD3, CD4, CD8 을 추가합니다.
둘, 동형 대비 (Isotypy? 컨트롤)
1, 왜 동형대조를 사용해야 합니까?
동형 대조는 일항과 같은 종의 출처, 같은 아형, 같은 복용량, 같은 면역 글로불린 및 아형의 면역 글로불린을 사용하여 항체 비특이성과 세포의 결합으로 인한 배경 염색을 제거하는 데 사용된다. 동형 대조는 진정한 의미의 음성 대조로, 스트리밍 세포계의 전압을 설정하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라 비싸고 번거로운 재구성 세포인자 경쟁 폐쇄 단계도 없앨 수 있다. 유동 세포 계측법 앞에서 염색하는 방법은 다음과 같습니다:
샘플 튜브: 일항+샘플
동형 대조군: 동형 대조군+샘플
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일반적으로 항거성분과 정확히 같은 종원, 같은 아형과 아체인, 같은 형광표기의 항체 (예: CD56) 를 선택하는가? APC 마크 항체, 화물번호는 55518, 성분은 Mouse? IgG1, κ. 그렇다면 그 동형 대비는 APC 마크의 Mouse 여야 할까요? IgG1, κ, 화물번호는 555751 입니다. 동형대조의 성분은 그 이름과 동일하다는 점에 유의해야 한다. 항체 조합형이 순화한 일항+형광마크의 이항이라면 일항동형대조를 선택해야 한다. 예를 들어 CDw125 의 순화 항체, 화물번호는 555901, 성분은 Mouse? IgG1, κ. 그 동형 대조군은 순화된 Mouse 인가? IgG1, κ, 화물번호는 555746 입니다. 그것의 2 항 PE 마크의 항마우스 IgG1, 화물번호는 550083 입니다. 그래서 염색 방법은 다음과 같습니다:
샘플 튜브: 정제 된 CD W25+PE 마커 안티 마우스? IgG1＋+샘플
동형 대조군: 정제 된 동형 대조군+PE 마커의 항모? IgG1＋+샘플
적절한 동형 대조를 찾을 수 없고, 출처가 같고, 형광표기가 같고, 면역 글로불린 범주가 같은 조건에서 우선 순위는 아체인 (아형) 이 달라야 합니다. 아형이 다릅니다. 같은 범주입니다. 예를 들어, 어떤 종류의 항체 소스는 Mouse 입니까? IgG2а, κ.
동형 비교표에서 정확히 같은 동형 대조를 찾을 수 없다면 같은 형광 마크의 Mouse 를 우선적으로 선택하시겠습니까? IgG2а г 는 동형 대조군이다. Mouse 도 찾지 못했다면? IgG2а г, 그럼 같은 형광 마크의 Mouse 를 우선적으로 선택하시겠습니까? IgG2b 는 동형 대조군으로 사용됩니다. 결국 모쉬를 찾지 못했다면? IgG2b, 그럼 선택자가 같은 형광 마크의 Mouse? IgG2 는 동형 대조군으로 사용됩니다.
3, 동형 대조군은 어떻게 찾습니까?
동형은 BD 영어 디렉토리나 BD 웹 사이트에서 그것과 대비되는 항체 위치와 일치한다. BD 카탈로그에서 항인의 항체 동형 대조는 모두 HUMAN 장 뒤에 있다. 항쥐의 항체 동형과 무스 장 뒤, 비인간 영장류의 항체 동형이 NON 에 비해? 허먼? PRIMATE 장 뒤에 있습니다. 항다람쥐의 항체 수가 매우 적기 때문에, 대부분의 항체 () 는 모두 쥐의 원천이기 때문에, 그것의 동형 대조는 쥐와 마찬가지로 MOUSE 장 뒤에 놓여 있다. 세포 내 사이토 카인, 케모카인, 보체, 염증 매체 및 그 수용체의 동형 대조군은 장 뒤에 놓여 있다 (참고: 사람의 세포 내 사이토 카인의 동형 대조군은 사람의 표면 표지의 동형 대조군과 함께 있지 않다). Phosflow 의 동형 대비는 Phosflow 의 소개 뒤에 있다. 예를 들어, 안티-인간 CD56 처럼? APC 마크 항체, 화물번호는 55518, 06 판 BD 카탈로그의 169 페이지에, 성분은 Mouse? IgG1, κ. 그럼 그 동형 대조는 HUMAN 장에서 Mouse 에 있어야 하나요? Immunoglobulin? Isotype 양식, 191 페이지, APC 태그 Mouse? IgG1, κ, 화물번호는 555751 입니다.
4, 어떤 고객이 동형 비교를 사용해야 합니까?
A? 스트리밍에 익숙하지 않은 고객입니다.
B? 포내 세포인자, 케모카인, 신호단백질 등과 같은 포내 스트리밍 고객을 만듭니다.
C? 흔하지 않은 로고나 특이성이 높지 않은 로고를 사용하는 고객. 고객들이 흔하지 않은 로고의 표현에 익숙하지 않기 때문에 동형 대조에 따라 양성세포의 위치를 판단할 수 있기 때문이다. 일부 특이성이 높지 않은 항체 (예: 다항제, 비특이성 결합, 동형 대조를 사용하면 위양성을 배제할 수 있다.
D? 흐름에 익숙하고 일반적으로 사용되는 표면 로고를 사용하는 고객은 일반적으로 동형 대조를 사용하지 않을 수 있습니다.
5, 왜 때때로 같은 유형의 대조군의 표현이 항체 표현보다 높습니까?
먼저 동형 대조군의 항체 추가 유형, 복용량 등을 점검해야 한다. 둘째, 세포의 표면이나 세포 내 표현이 높지 않고 이와 유사한 항원이 많기 때문에 동형 대조를 추가할 때 동형 비특이성의 결합은 항체 특이성을 초과할 수 있기 때문에 이런 현상을 일으킬 수 있다. 세포 표면에서는 그림과 같다. 이때 다른 음성 통제 (예: 공백 통제 등) 를 사용하는 것이 좋습니다.
3, 보정 마이크로구
스트리밍 세포계의 형광 보정은 일정 기간 후에 적당한 위치로 조정해야 합니다. 형광 보정이 잘 조절되지 않으면 세포 그룹화가 뚜렷하지 않거나 스트리밍 감지 결과 그래프가 매우 예쁘지 않고 테스트 결과의 비현실성에 영향을 줄 수 있습니다. 형광 보상 조절은 초보자에게는 쉽게 파악할 수 없고, 보상 조절은 스트리밍 세포술에서 비교적 파악하기 어려운 조작이다. 특히 흔하지 않은 로고 감지 시에는 경험이 많은 스트리밍 운영자가 다년간의 경험 판단에 따라 보상을 조절해야 더 나은 데이터와 사진을 얻을 수 있다. (데이비드 아셀, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 예술명언) 그럼, 지금 이렇게 번거로울 필요는 없습니다. 마이크로볼을 보정하면 모든 것이 더 쉬워지기 때문이다. BD? CompBeads 는 스트리밍 세포계 다색 분석을 위한 형광 보정 조정 마이크로볼입니다. 실용성은 기존의 일반적인 3 색 이상의 스트리밍 분석을 할 때 보정난조, 소모샘플 (종종 측정 대상 샘플 단일표로 보정 조정) 의 단점을 극복하는 데 있다. 그 자체로는 형광을 휴대하지 않고 고객 자신의 특이성 형광 항체 부화와 결합하여 보상을 조절한다.
측정 중인 샘플 세포처럼 같은 실험 조건에서 고정, 파막 등을 할 수 있을 뿐만 아니라 조작이 간단하고 감도가 높고 일관성이 좋아 보상이 쉽고 정확하며, 가장 보기 드문 것은 다색 분석 (예: 5 색, 6 색, 7 색 등) 과 복합 형광소 (예: PE-Cy7) 에 가장 적합하다는 점이다. 각 모델의 스트리밍 기기는 모두 사용할 수 있다. 컴피베드 사용 후 스트리밍 조건을 저장해 다음에 같은 형광 염색을 할 때 참고용으로 사용할 수 있습니다.