유전자 보고: 감지할 수 있는 단백질이나 효소를 코딩하는 유전자, 즉 그 표현 산물을 쉽게 식별할 수 있는 유전자.
일반적으로 보고 유전자의 코딩 서열은 유전자 표현 조절 서열과 융합되어 키메라 유전자를 형성하거나 다른 표적 유전자와 융합하여 그 표현 산물을 이용하여 표적 유전자의 표현 조절을 교정한다.
보고 유전자는 유전자 발현 조절 연구에 널리 사용된다. 녹색 형광 단백질 (GFP) 과 형광소 효소를 예로 들 수 있습니다.
형광소 효소는 다른 기질의 산화발광을 촉진하는 효소이다. 포유류 세포에는 내원성 형광소 효소가 없다.
Fluorescein 효소는 유전자의 장점을 보고합니다
단백질은 번역 후 가공을 할 필요가 없기 때문에 일단 번역하면 즉시 보고 활성화를 일으킨다.
모든 화학 발광 반응 중에서 그 빛의 산물은 양자 효율이 가장 높기 때문에 매우 민감하다. 또한 숙주 세포와 검사 시약 중에는 배경 발광을 감지할 수 없습니다.
빠른 감지, 샘플당 몇 초 밖에 걸리지 않습니다.
둘째, 실험 원리
형광소 효소와 기질 사이의 화학발광반응을 바탕으로 관심 있는 유전자 전사 조절 요소를 반딧불 형광소 유전자의 상류로 복제해 형광소 효소 보고 플라스미드를 구축했다. 그런 다음 세포를 전염시켜 적절한 자극이나 처리 후에 세포를 분해하고 형광소 효소 활성을 측정한다. 형광소 효소의 활성화를 통해 자극 전후 다른 자극이 관심 있는 조절 요소에 미치는 영향을 판단한다.
동시에 내부 변화 요인의 영향을 줄이기 위해 (예: 배양 세포의 수와 활력의 차이, 세포 전염과 분열의 효율성 등). ), Rinilla 형광소 효소 (phRL-TK) 가 있는 플라스미드를 대조군 입자와 리포터 유전자 플라스미드 * * * 로 세포를 감염시켜 전사 활성성의 내부 대조를 제공하여 테스트 결과가 실험 조건의 변화에 지장을 받지 않도록 한다. 측정 과정에서 형광소 효소를 넣어 시약 II (LARII) 를 감지할 때 반딧불 형광신호를 만들어 반딧불 형광소 효소 보고 유전자를 먼저 측정한다. 반딧불의 형광 강도를 정량화 한 후 중지&; 글로? 시약, 이 같은 반응을 담금질시키고, 동시에 해신장의 형광소 효소 반응을 시작하면서 동시에 두 번째 측정을 진행한다.
셋. 운영 절차 및 결과 결정
A. 시험 전 관련 시약 준비
1 ..? 1X PLB 크래킹 버퍼의 준비: 1 이중 볼륨 5X PLB 크래킹 버퍼에서 4 배의 물 또는 PBS 를 추가합니다. (사용하기 전에 실온에서 1X 완충액의 균형을 잡는 데 2-3 분 정도 걸립니다.)
2.? 형광소 효소 검사 시약 II (LAR II) 의 제비: 형광소 효소 검사 완충액 II 를 형광소 효소 검사 기질에 넣고 충분히 섞고, 나누어, 빛을 피하고-20 C 를 보존한다. (준비한 후 작은 시험관에 나누어 반복 동결 융해를 피하다.) 사용하기 전에 준비한 LAR II 를-20 C 에서 꺼낸 후 실온으로 균형을 맞추세요 (20-30 분 소요).
3.? & ampGlo 중지? 시약 준비: 즉시 사용 가능한 준비, 첫 번째 정류장&; 글로? 완충액을 37 도 배양함에 넣어 실내 온도 (15-30min) 까지 균형을 잡은 다음 50xStop &; 글로? 기질은 49 배 부피의 Stop &；; 글로? 완충 중.
B. 샘플 준비
1 ..? 검사할 세포 구멍에서 성장 배양기를 조심스럽게 빨아들인다. 1XPBS 로 세포를 2-3 회 헹구다. 이 과정은 반드시 조심해야 한다. 가능한 PBS 로 세척액을 흡수한다 (세포가 떨어지는 것을 방지함).
2.? 24 오리피스 판의 각 구멍에100-150 μ l1X PLB 분해 버퍼액을 추가하여 세포를 덮은 다음 발열기에서 24 오리피스 20-30 분을 흔들어 분해버퍼액이 세포를 완전히 분해하도록 합니다.
C. 이중 형광 효소 검출 (Promega GLOMAX) (주의: 시스템이 실행 중일 때 작동 화면을 만지지 마십시오)
1 ..? 시스템 재설정: 도구? 재설정 설정
2.? 이중 형광 효소 검출 프로그램 설정;
합의? Promega 프로토콜을 실행하시겠습니까? DLR-O-INJ OK
3.? 50μl LAR II 를 1.5ml EP 튜브 (전용 수입 EP 튜브) 에 추가하고 10μl 세포 분해액을 LAR II 가 장착된 1.5ml EP 튜브에 추가합니다 (사용하기 전에 LAR II 는 실내 온도에 고르게 혼합되어 균형을 맞춰야 합니다. ) 을 참조하십시오
4.? 측정이 끝나면 EP 튜브를 제거하고 50μl STOP &；; 글로? 시약, 2 ~ 3 회 섞어주세요 (가능한 거품을 불지 않도록). 탐지기를 다시 넣고 "측정" 을 클릭하여 판독 (내삼해신장의 형광소 반응 강도) 을 시작합니다. (& 중지
글로? 시약 현재 사용 가능하여 저장할 수 없음)
5. 기록 판독값: 샘플당 rlu 1- 반딧불 형광소 반응 강도, rl U2- 내삼 해신 형광소 반응 강도, 비율 -RLU 1/RLU2 의 세 가지 값이 있습니다. 일반 기록 비율은 괜찮지만 RLU 1 및 RLU2 는 세포의 형질 감염 효율을 반영하는 실제 형광 강도 값이며, 보고 플라스미드와 내삼의 비율도 실제 형광 강도에 따라 조정될 수 있습니다.
6. 측정이 끝나면 마지막으로 감지된 EP 튜브를 제거하고 기기를 끄십시오.
7. 실험 결과 처리 및 분석: 이중 샘플 등 분산 T 검사로 처리하고, P < 0.05 는 현저한 차이, P < 0.0 1 은 매우 큰 차이입니다.
넷째, 주의사항
1. 온도가 효소 반응에 영향을 미치기 때문에 샘플과 시약 모두 측정 전에 실온에 도달해야 한다.
2. 해신 형광소 효소 검사용 작업액은 조제 직후 사용해야 하며, 조제 후 장기간 보존하면 안 됩니다.
3. 형광소 효소 검출 시약 II (LAR II) 는 반복적으로 해동할 수 없으므로 매번 같은 배치의 LAR II 를 사용할 수 있다. 준비한 LAR II 는-20 C 에서 한 달 동안 안정적으로 보관할 수 있고-70 C 에서는 1 년 동안 안정적으로 보관할 수 있다.
4. 시약 보관 및 사용시 빛을 피해야합니다.
5. 최상의 측정 효과를 얻기 위해 샘플과 측정 시약 혼합부터 측정 시간까지 가능한 한 같은 시간 (1-2 초) 동안 제어해야 합니다.
6. 사용 중 조작 화면을 만지지 마십시오 (프로그램이 종료되거나 취소됨).
7. 평소에 가급적 기기를 이동하지 말고 터치스크린이 움직이지 않도록 하세요.