< P > 하하하, 그동안 임상과 연구실에서 작은 팽이처럼 모든 것이 엉망진창이고 아무것도 이해하지 못했기 때문이다. 이제부터는 새사람이 되고, 모든 것을 보고 자세히 알아보고, 그룹에서 자꾸 듣지만 이해하지 못하는 cre 야, loxp 야, reporter 쥐야, 너무 어려워, 가서 알아봐, 무슨 귀신이야. < P > 이전에는 이 물건을 전혀 이해하지 못했고, 유전자 재조합 마우스 실험에 접촉한 적이 없다. 관련 문장 를 보러 갔는데, 그 안에 이 유전자 재편성 기술 이 포함되어 있어 친구와서야 Cre-Lox 가 동물 실험에서 매우 많이 쓰이는 기술이라는 것을 알게 되었다. 정리된 내용은 바로 지금 자신이 이해하고 있는 것입니다. 어디가 잘못되었는지 시정해 주십시오. 눈물을 머금고 대단히 감사합니다. 또한 그것을 이해하지 못하는 사람들에게 도움이 되는 정보를 제공하기를 바란다.
Cre 는 미생물에서 발견된 유전자로, Cre recombinase 를 코딩할 수 있으며, Cre 재조합 효소는 Loxp 시퀀스라고 하는 특이성 서열을 인식할 수 있으며, 이 서열은 34bp 길이라고 합니다. Cre 재조합 효소는 Loxp 서열을 인식하고 Loxp 이전의 유전자/서열을 수정하며 (Loxp 방향에 따라 위키피디아를 자세히 소개하는 것이 좋습니다. 여기서는 이 기술인 knockout gene 을 자주 사용합니다.
일반적으로이 유전자 재조합 기술은 하이브리드 화를 사용합니다. 예를 들어, 아버지 쥐의 특정 유전자 A (우리가 관심 있는 유전자, 예를 들어 세포 상태/조직 특이적으로 표현된 유전자) 에서 배아 시기 수정 및 Cre 유전자 서열 삽입, 그 이후 모든 세포의 게놈에 Cre 유전자 서열, Cre 유전자의 표현 및 번역은 이 특이성 유전자 A 의 발동기에 의해 영향을 받습니다. 즉, 세포 중 A 유전자가 < P > 하지만 아직 끝나지 않았습니다. Cre 전사 후 목적은 단백질을 코딩하는 것입니다. Cre 재조합 효소라는 것은 FLox 가 필요합니다. 일반적으로 Loxp 는 두 Loxp 사이에 있는 서열이나 유전자를 잘라서 생물학적 역할을 하기 위해 어머니 쥐 안에 있다. (알버트 아인슈타인, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 가족명언) 제가 본 이 문장 역시 배아 세포가 어머니 쥐의 Rosa26 지역/유전자의 두 엑손 사이에서 Loxp 서열로 옮겨지기 시작했으며, Loxp 가운데는 STOP 유전자가 있는데, 이 서열은 하류의 유전자가 전이되는 것을 막을 수 있습니다. 아직 끝나지 않았거나 Rosa26 유전자의 두 가지 또 다른 reporter gene 이 추가되었는데, 보고 유전자에는 일반적으로 LacZ, GFP, YFP, etc 가 포함되어 있습니다 (이러한 보고 유전자를 이해하지 못하면 위키피디아가 자세한 소개를 하는 것이 좋습니다.) 그래서 일반적으로 어머니 쥐의 전체 세포에서 Rosa26 유전자는 STOP 서열로 옮겨져 멈췄습니다. 또 한 가지 언급해야 할 점은 Rosa26 이 쥐에서 거의 모든 세포/조직이 전사한다는 점이다. 하지만 이 유전자는 별 소용이 없다. 그래서 여기에 다양한 수정을 추가해도 쥐의 건강에는 영향을 미치지 않는다. 자, 이제 A 유전자 -Cre 아버지 쥐와 Rosa26-Loxp-reporter 어머니 쥐가 생겼고, 그다음은 그들이 한가하게 쥐를 만들지 않도록 하는 것이다. 그들의 아이들은 일반적으로 a-cre:: rla cz/a-cre:: rgfp/a-cre:: ryfp/etc, "::"는 무엇을 의미합니까? 그렇습니다.' 교배' 이기 때문에 이 잡교 쥐는 일반적으로 연구의 목적 샘플입니다. 이 세대에서 태어난 쥐들에게는 동시에 두 개의 유전자가 손질된 곳이 포함되어 있기 때문에, 하나는 A 유전자이고, 하나는 Rosa26 지역/유전자이기 때문이다. (윌리엄 셰익스피어, Northern Exposure (미국 TV 드라마), 유전자명언) 목적 유전자 A 는 일반적으로 특이적이어야 하며, 특정 세포나 특정 조직특이 표현 (일부 마크커 유전자) 에서만, 이 A 유전자가 표현하는 세포/조직에서도 Cre 를 따라 표현한다. Cre 는 A 유전자의 시동자에 의해 엄격하게 조절되고, Cre 의 mRNA 는 Cre 재조합 효소로 코딩되어 일하러 나간다 (세포의 주요 기능 구현자는 단백질이다). Cre 재조합 효소의 발현에 따라 Rosa26 의 두 엑손, 두 Loxp 서열 사이의 STOP 유전자가 차단된다. 그래서 바로 뒤의 Repoter gene 이 전사를 시작하면서 대변이 잘 통하는 발길이 막히기 시작했다. (윌리엄 셰익스피어, 레어, 레어, 레어, 레어, 레어, 레어, 레어, 레어) 그래서 우리는 Repoter 유전자 산물을 검출함으로써 조직 염색, in situ hybridization(ISH) 염색, 형광 검사, etc 와 같은 세포를 간접적으로 감지할 수 있습니다. < P > 이때' 그럼 특이유전자 바로 뒤에 repoter gene 을 넣으면 쉽게 할 수 있지 않을까?' 라고 물어볼 수 있다. 하필 이렇게 번거로울 필요가 있는가, 이리저리 만지작거려도 성교가 필요하다. (윌리엄 셰익스피어, 템페스트, 희망명언) A 유전자에 첨가된 Cre 든, 아니면 repoter gene 을 직접 넣든 간에, 그들은 A 유전자의 활성화 조절을 직접/즉시 받아 매우 동기화된다. 유전자 재조합 마우스의 경우는 그렇지 않습니다. Cre 재조합 효소 발현 후 세포의 STOP 유전자를 역전시킬 수 없으며, repoter gene 은 계속 표현될 것입니다. 즉, 나중에 Cre 유전자가 전사되지 않더라도, repoter gene 이 그 세포에서 발현되는 것을 볼 수 있습니다. 갑자기 이 기술을 생각해 낸 사람이 너무 대단하다고 느끼기 때문에 이 유전자 재조합 기술은 일반적으로 추적 조사에 사용될 수 있다.
Cre/LoxP 시스템은 F1 파지에서 유래한 것으로 매우 고전적이고 효과적인 유전자 편집 기술입니다.
Cre 재조합 효소 (cyclizationrecombination) 는 loxP 부위의 DNA 재구성을 유발할 수 있는 343 개의 아미노산으로 구성된 단량체 단백질입니다.
Cre 는 LoxP 부위를 인식하는 재조합 효소입니다.
inducible cre: these constructs require the addition of an exogenous ligand (e.g. tamoxifen) To activate Cre.one advantage of this system is tight temporal regulation.
(1) Cre 유도: 이러한 구조에는 cre 를 활성화하기 위해 타목시펜과 같은 외부 리간드를 추가해야 합니다 이 시스템의 장점 중 하나는 엄격한 시간 관리입니다. 이것은 우리가 가장 많이 사용하는 것입니다!
promoter-regulated cre: the promoter region defines the areas in which cre will be expressed.cre may be expressed globally Ve promoter like CAG, or expressed only in a subset of cells under a more specific promoter (e. g. rho-Cre is expressed in the reter) Cre 는 CAG 와 같이 광범위하게 활성화된 프로모터 (예: CAG) 에서 전역적으로 표현되거나 특정 프로모터 아래의 세포 하위 집합에서만 표현될 수 있습니다 (예: Rho-Cre 가 망막에서 표현됨).
fluorescent Cre: the fusion of cre to a fluorescent reporter enables visualization of cre expression.
(3) cre 및
optimized cre: codon-optimized cre (icre) is expressed at higher levels in mice than P1 bacteriophage cre, Facilitating high rates of cre-driven recombination.crem (or cre-m) has been engineered to contain an intron, Preventing cre expression when cloning in e.coli.this alteration enables the generation of a single vector containing cre and a flo xed connong Modified cre will cause recombination in E.coli, Deleting the flo xed portion of a construct during the cloning process) . vcre and screare alternative cre recombinases that recognize specific mutant loxp sites ， Vlo XP and SLO XP sites respectively.
(4) 음 ... 너무 복잡
split cre: cre recombinase is split in half into n and c termine CCre, Respectively) 를 참조하십시오 And placed under the control of different promoters.expression of both n and cccre in the same cell type allows for recombination of loxp flanked ded Sequences.
(5) Cre 재조합 효소를 각각 NCre 와 C 측 CRE 조각 (각각 NCre 와 CCre) 으로 나누어 서로 다른 프로모터의 통제 하에 배치합니다. 같은 세포 유형에서 N 과 CCre 의 표현을 통해 LoxP 측 DNA 서열을 재구성할 수 있습니다.
loxP 는 34bp 길이의 DNA 시퀀스로, LoxP (1 Cus of X-Overin P1) 라고 하는 재조합 효소가 인식하는 부위입니다.
참고 자료:
/blog/introduction-to-Crec-LoxP
https://www.addgene .. 일반적인 시공 유형은 다음과 같습니다.
(1) Cre 에 의존하는 유전자 표현: 관심 있는 유전자 상류의 어느 한 쪽 ("lox-stop-lox" 또는 "LSL" 상자) 에 loxP 점이 있는 정지 암호를 배치합니다. Cre 가 존재하는 경우 코돈 절제를 멈추고 유전자 표현이 계속된다.
왜 갑자기 AAVS1 을 언급해야 합니까? 위에서 언급한 LoxP 는 LoxP 를 대상 유전자의 인트론 (가운데에는 외현자, 리본 외현자) 에 넣어야 한다는 것을 이미 알고 있기 때문이다. Cre 가 안정적인 표현을 원한다면 어떻게 해야 할까요? 이때 AAVS1 부위의 역할을 이용해야 한다. 이미 AAVS1 부위 (PPP1R2C 부위라고도 함) 가 인간 게놈 19 번 염색체에 위치하여 DNA 조각의 예상 기능으로 전입할 수 있도록 검증된' 안전항' 자리다. 이 부위는 개방된 염색체 구조로, 전입 유전자가 정상적으로 전사될 수 있도록 보장한다. 또 중요한 점은 이 부위에 외원 목적 조각을 삽입해 세포에 알려진 부작용이 없다는 점이다.