RT-PCR 검출 방법의 구체적인 단계는 다음과 같습니다.
(1) RNA 추출
1. 개수에 맞춰 RLT 용액을 분주합니다. 검체: 키트에서 꺼냅니다. RLT 용액을 튜브당 500μL씩 1.5mL 원심분리 튜브에 분배합니다(시스템 준비 영역에서 작동).
2. 생물안전 캐비닛에서 RLT 액체에 샘플링액(비강 면봉, 인후 면봉, 흉막 삼출액 등) 또는 바이러스 배양액(닭 배아 요막액 또는 세포 배양액) 100μL를 추가합니다. 튜브 미디엄을 잘 섞으세요. 3. 각 튜브에 5 μL의 β-mercapto에탄올을 첨가하고 잘 섞은 후 600 μL의 70% 에탄올을 순서대로 첨가하고 잘 섞습니다.
4. 필터 컬럼이 포함된 2mL 수집 튜브를 키트에서 꺼내어 포장을 열고 라벨을 붙입니다. (3)단계의 혼합 용액 600 μL를 필터 컬럼에 추가하고 15초 동안 12,000rpm으로 원심분리한 다음 원심분리된 용액을 수집 튜브에 폐기합니다.
5. 필터 컬럼을 다시 수집 튜브에 놓은 상태에서 (3) 단계에서 남은 혼합물을 모두 필터 컬럼으로 흡입하고 12,000rpm에서 15초 동안 원심분리한 후 원심분리기를 폐기합니다.
6. 필터 컬럼에 세척 완충액 RW1 용액 700μL를 추가하고 12000rpm에서 15초 동안 원심분리합니다.
7. QIAGEN RNeasy 미니 키트에서 깨끗한 2mL 수집 튜브를 꺼내 원심분리된 필터 컬럼을 새 수집 튜브로 옮긴 다음 필터 컬럼에 500μL 세척 버퍼 RPE 용액을 추가하고 12000rpm으로 15초 동안 원심분리합니다.
8. 수집 튜브에 있는 원심분리액을 버리고 필터 컬럼에 세척 완충액 RPE 용액 500μL를 추가한 후 13000~14000rpm에서 2분간 원심분리합니다.
9. 필터 컬럼을 깨끗한 1.5mL eppendorf 튜브로 옮기고 30~50μL RNase-free Water를 필터 컬럼에 첨가한 후 실온에서 1~3분 동안 방치합니다.
10. 12000rpm으로 1분간 원심분리하여 바이러스 RNA를 추출한 후 즉시 실험하거나 -20℃ 이하에 보관한다.
참고: Buffer RPE 사용 사이에 무수 에탄올 44mL를 추가하세요.
(2) 반응계 준비
1. 실험설계 : 시료 RNA 검출
음성대조군 : 멸균수(시료 RNA 추출시 사용) 검체와 동시에 멸균수 추출 ) 양성대조군 : 알려진 바이러스 RNA
2. PCR 반응 시스템 준비 (시스템 준비 영역에서 반응액 준비) 1) 다음에 따라 시약을 추가합니다. 표: PCR 반응 시스템
각 확립된 반응에 대한 반응 수를 결정합니다(n = 수행할 PCR 튜브 수, 음성 및 양성 쌍 포함). 부정적인 템플릿 없는 컨트롤, 긍정적인 컨트롤 및 오류를 고려하여 과잉 반응 혼합물을 준비해야 합니다. 자세한 내용은 다음과 같습니다.
(1) 컨트롤이 포함된 경우 샘플 수(n)는 1~14이고 N=n+1입니다.
(2; ) 대조군이 포함된 경우 샘플 수(n)가 15보다 크면 N=n+2입니다.
2) 위의 반응액을 혼합하여 0.2mL PCR 튜브에 20μL씩 분주하여 각각 라벨링합니다.
3) RNA 템플릿 추가(핵산 추출 영역)
위에서 언급한 PCR 튜브에 템플릿을 추가합니다. 먼저 음성 대조 튜브(5 μL 멸균수)를 추가한 다음 샘플 RNA(각 튜브마다 5 μL)를 추가하고 마지막으로 양성 대조 RNA(각 튜브마다 5 μL)를 추가합니다.
3. RT-PCR 반응
위에서 추가한 템플릿과 반응 튜브를 섞은 후 간단히 원심분리한 후 PCR 기계에 넣어 RT-PCR 증폭을 수행합니다.
4. RT-PCR 산물 검출
1) 2.0% 아가로스겔 준비 : 아가로스 2.0g을 달아 내열유리병에 붓고 전기영동용액을 넣는다( 1×TBE) 100mL를 천천히 섞은 후 가열하여 Agarose를 완전히 녹입니다.
Agarose gel의 온도가 약 50~60°C로 떨어지면 핵산염료를 넣고 가볍게 섞어주세요(거품이 생기지 않도록). 겔 온도가 약 50°C로 떨어지면 겔 제작 플레이트에 붓고 전기영동 빗을 삽입합니다. 접착제가 완전히 굳은 후(약 30~60분) 빗을 빼냅니다.
2) 준비된 전기영동 젤을 전기영동 탱크(빗살 구멍이 있는 쪽이 음극에 있음)에 넣고 전기영동 용액(1×TBE)을 젤 표면에 붓습니다.
3) 각 PCR 산물 10μL를 취하여 2μL의 로딩 버퍼(6×Loading Buffer)를 첨가하고 혼합하여 전기영동 젤 웰에 첨가합니다(먼저 5μL의 Marker(DL-2000)를 첨가한 후 추가) 순서대로 PCR 산물을 샘플링하고 음성 대조군을 추가한 후 마지막으로 양성 대조군 산물을 첨가합니다. 4) 전기영동 전압은 100V이며, 약 30~40분 후에 결과가 나옵니다. 5) 전기영동 젤을 젤 이미징 시스템에 넣고 결과를 관찰하고 사진을 찍습니다.
5. 결과 판단.